考馬斯亮藍(lán)染色測(cè)定蛋白質(zhì)含量

一、實(shí)驗(yàn)原理

考馬斯亮藍(lán)（Coomassie Brilliant Blue）測(cè)定蛋白含量存在著兩種不同顏色形式，紅色和藍(lán)色。此染料與蛋白質(zhì)結(jié)合后顏色由紅色形式轉(zhuǎn)變藍(lán)色形式，zui大光吸收由465nm變成595nm。在一定蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)和染料結(jié)合符合比爾定律（Beer’s law），因此可以通過(guò)測(cè)定染料在595nm處吸收的增加量得到與其結(jié)合的蛋白質(zhì)量。本法測(cè)定范圍為10~100µg蛋白質(zhì)。

由于該法簡(jiǎn)單、迅速、干擾物質(zhì)少、重復(fù)性好、靈敏度高，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)含量測(cè)定。

二、實(shí)驗(yàn)用品

(一)器材

    (1) 722分光光度計(jì)。

    (2) 微量進(jìn)樣器。

    (3) 移液管（0.1ml及5ml）。

    (4) 試管及試管架。  

(二 )、試劑

     (1)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：結(jié)晶牛血清白蛋白，預(yù)先經(jīng)微量凱氏定氮法或按牛血清白蛋白OD1%1cm=6.6測(cè)定蛋白質(zhì)含量，再用0.15mol/L NaCl配制成1mg/ml蛋白質(zhì)溶液。

     (2)考馬斯亮藍(lán)試劑：考馬斯亮藍(lán)G-250 100mg溶于50ml 95%乙醇中，加入100ml 85%磷酸，用蒸餾水稀釋至1000ml，濾紙過(guò)濾。zui終試劑中含0.01%（W/V）考馬斯亮藍(lán)G-250，4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）磷酸。

    (三)材料

         末知蛋白質(zhì)溶液，要求蛋白質(zhì)濃度范圍為0.1~5mg/ml，若濃度過(guò)度時(shí)，需用0.15mol/LNaCl溶液適當(dāng)稀釋。 

三、實(shí)驗(yàn)程序

  （一）操作方法

   1.標(biāo)準(zhǔn)法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

    取14支試管，分兩組按表1-1平行操作。

以OD595為縱坐標(biāo),標(biāo)準(zhǔn)蛋白為橫坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

 2.微量法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

    取12支試管，分兩組按表1-2平行操作。

3.末知樣品蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定 

  測(cè)定方法同上，取合適的末知樣品體積，使其測(cè)定值在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的直線(xiàn)范圍內(nèi)，根據(jù)所測(cè)定的OD595值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查出其相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)蛋白的量，從而計(jì)算出末知樣品的蛋白質(zhì)濃度（mg/ml）。